Como montar e processar um bloco parafinado para ratos na prática
Processar tecidos de roedores em parafina é uma rotina comum em laboratórios de patologia e histologia, mas tem suas armadilhas, principalmente quando se trabalha com animais adultos de porte médio ou grande. O bloco parafinado para ratos nada mais é do que uma peça de cera termo-reversível que envolve o tecido fixado, permitindo o corte fino em micrótomo para análise microscópica. O processo parece simples na teoria, mas a prática exige atenção a detalhes que costumam ser negligenciados.
O que você precisa saber antes de começar um bloco parafinado para ratos
A fixação é o passo mais crítico e o que mais influencia a qualidade final. Para ratos adultos, a perfusão transcardíaca com fixador à base de formaldeído (como formol neutro tamponado a 10%) produz resultados muito superiores à imersão simples. Quando você apenas submerge o órgão ou o animal inteiro em fixador, a difusão atinge uma espessura máxima de cerca de 3 milímetros por hora. Um rim de rato adulto pode ter 8 a 10 milímetros de espessura no eixo transversal, o que significa que o centro demora mais de 24 horas para fixar adequadamente. Tecido mal fixado se fragmenta durante a dessedatação e não responde bem ao corte no micrótomo. A desidratação segue uma série crescente de etanol, geralmente começando em 70% e indo até 100%, passando por estações intermediárias como 80% e 95%. O tempo em cada estação varia conforme o tamanho do espécime. Parabiópsias de fígado de rato de 200 gramas precisam de cerca de 2 horas na primeira estação de 70% e 1 hora nas estações de 100%. Espécimes maiores, como um rim inteiro, exigem períodos mais longos — algumas vezes 4 a 6 horas na última mudança de etanol absoluto. O excesso de umidade residual é a principal causa de falha na infiltração posterior com parafina.
O passo de clarificação usa xileno ou substitutos menos tóxicos para remover o etanol e preparar o tecido para a parafina. Duas trocas de xileno de 30 minutos cada são o padrão para a maioria dos espécimes de rato. Se o tecido ainda tiver etanol retido, a parafina não penetra uniformemente, resultando em áreas moles no bloco que se desfazem durante o corte. Isso gera fatias incompletas e dificuldade para coletar a fita de cortes no micrótomo. A infiltração em parafina requer temperaturas controladas. A parafina de fusão média (entre 56°C e 58°C) é a mais usada para tecidos de rato. O tempo de infiltração em estufa varia de 2 a 4 horas, dependendo do volume do espécime. Duas trocas de parafina fundida são preferíveis a uma única imersão longa, pois garantem que todo o solvente organêmico tenha sido substituído pelo material de suporte adequado.
O problema que eu encontrei e como resolvi
Uma vez, processei um ratinho adulto inteiro para análise histológica sistêmica. O animal estava fixado por perfusão corretamente, mas ao tentar fazer cortes de 4 micrômetros em seções que continham vértebras lombares, o micrótomo simplesmente não conseguia avançar. O osso quebrava a lâmina e destruía os cortes adjacentes de tecido molet. A solução foi mais simples do que parecia: usei uma serra de oscilação ou um microtomo de serra para fazer uma seção prévia removendo as vértebras, e só então embuti o tecido mole separado em novo bloco. O osso foi descartado para fins de secção histológica, já que o objetivo era analisar parênquima e não arquitetura óssea. Se você trabalha frequentemente com ratos inteiros, vale aprender a dissecar e separar órgãos antes da fixação ou, no mínimo, remover o esqueleto axial logo após a fixação, se o protocolo permitir.
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Montagem no molde e orientação do bloco
A montagem do bloco parafinado para ratos exige decisão sobre a orientação do tecido. Secções transversais de intestino mostram camadas de forma diferente das secções longitudinais. Para biópsias de rim, a orientação polar é essencial para visualizar néfrons inteiros de córtex a medula. Coloque uma gota de parafina fundida no fundo do molde, posicione o tecido com pinças aquecidas levemente, e adicione parafina ao redor até preencher. Use um bastão de vidro aquecido para ajustar a posição sem danificar o tecido. Deixe solidificar em uma placa fria ou sob fluxo de ar condicionado por alguns minutos. O trimamento inicial com uma lamina de navalha ou máquina de trimamento do micrótomo remove o excesso de parafina até expor a superfície do tecido. Corte em fatias de aproximadamente 50 a 100 micrômetros nessa fase. A velocidade do trimamento deve ser lenta para não perder a superfície alvo. Quando o tecido estiver visível e plano, reduza a espessura de corte para 3 a 5 micrômetros, que é a faixa ideal para colorações com hematoxilina e eosina.
Dificuldades comuns e como evitar
Brocas de corteonduladas ou com bordas serrilhadas são um dos problemas mais frequentes em cortes de tecidos de rato. A causa mais comum é parafina de qualidade inferior ou temperatura de corte inadequada. Se a sala estiver muito quente, acima de 22°C, a parafina amolece e os cortes ficam com aspecto irregular. O ideal é manter a sala entre 18°C e 20°C, especialmente em épocas de verão. Outro fator é a umidade relativa do ar; cortes tendem a enrolar mais em ambientes secos. Um nebulizador com água destilada próximo ao micrótomo ajuda a manter a flexibilidade da fita de cortes. Cortes que se rasgam ao serem coletados na água morna do coletor muitas vezes indicam que o tecido não está bem infiltrado ou que a parafina está contaminada com solventes residuais. Em casos assim, o mais prático é derreter o bloco e a infiltração com parafina fresca, evitando reutilizar a mesma parafina por mais de duas infiltrações consecutivas.
Tecidos ricos em colágeno, como pele e cápsulas de órgãos, apresentam dificuldade adicional de corte porque são mais resistentes e elásticos. Nesses casos, aumentar ligeiramente a dureza da parafina usando um tipo de fusão mais alta (60°C a 62°C) melhora o suporte durante o corte. A desvantagem é que a extração de corantes fica mais difícil durante a reidratação posterior, exigindo tempos um pouco mais longos nas estações de xileno e etanol reverso.
Quando o bloco parafinado para ratos não é a melhor opção
Existem situações em que a técnica de parafina não é a ideal. Estudos que exigem preservação de antígenos imunohistoquímicos sensíveis ao calor frequentemente preferem cortes em congelador com O.C.T. Compound. A fixação em formol e a temperatura da parafina (cerca de 60°C) podem destruir epitopos importantes para imunomarcação. Se seu protocolo inclui imunohistoquímica de rotina, vale testar seções congeladas primeiro em um espécime piloto antes de comprometer todo o material em parafina. Também há casos em que a análise estrutural em alta resolução de estruturas delicadas, como neurônios inteiros ou fibras musculares com striações finas, se beneficia de técnicas de resina epóxi. A parafina não oferece suporte rígido suficiente para cortes abaixo de 1 micrômetro, enquanto resinas como a Epon permitem espessuras de 0,5 micrômetros com excelente preservação morfológica. A desvantagem é que o processamento em resina leva de 2 a 3 dias, contra 1 dia para parafina, e a coloração com H.E. padrão não funciona — é necessário usar colorações específicas para resina.
Se você precisa processar muitos espécimes de rato em paralelo e o volume de trabalho é alto, considere automatizar as etapas de desidratação e clarificação com um processexador de tecidos automático. Equipamentos como os da linha Autotechnicon reduzem o tempo total de processamento de um dia completo para cerca de 18 horas, com reprodutibilidade muito maior do que o método manual. O custo do equipamento é elevado, mas o ganho em consistência e tempo geralmente compensa em laboratórios com produção contínua.
